11 / 62
11
ปีที่ 46 ฉบับที่ 211 มีนาคม - เมษายน 2561
เทคนิคพีซีอาร์ อาศัยการควบคุมอุณหภูมิและเวลาด้วยเครื่องพีซีอาร์
ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน ดังนี้
1.
ขั้นตอนการแยกดีเอ็นเอเป็นสายเดี่ยว (Denaturation step)
คือ การท�ำให้
ดีเอ็นเอเสียสภาพธรรมชาติจากดีเอ็นเอสายคู่กลายเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยว
ขั้นตอนนี้ใช้อุณหภูมิสูง 93-95 องศาเซลเซียส เพื่อท�ำลายพันธะไฮโดรเจน
ที่ใช้ในการจับคู่กันของสายดีเอ็นเอ เพื่อเปิดโอกาสให้ไพรเมอร์เข้าไปจับกับ
บริเวณที่จ�ำเพาะในขั้นตอนต่อไป
2.
ขั้นตอนการจับระหว่างไพรเมอร์กับดีเอ็นเอต้นแบบ (Annealing step)
หลังจากที่ดีเอ็นเอแยกเป็นสายเดี่ยวแล้ว ลดอุณหภูมิลงมาที่ 35-65 องศา
เซลเซียส ไพรเมอร์ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยวสายสั้นๆ ประมาณ 10-25 เบส
จะเข้าไปเกาะบริเวณที่เป็นคู่สมกันบนสายดีเอ็นเอต้นแบบ ซึ่งขั้นตอนนี้
จะเลือกบริเวณดีเอ็นเอที่ต้องการเพิ่มปริมาณได้อย่างจ�ำเพาะเจาะจง
3.
ขั้นตอนการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ (Extension step)
หลังจากไพรเมอร์เกาะกับดีเอ็นเอต้นแบบ เมื่อเพิ่มอุณหภูมิ
ขึ้นเป็น 68-72 องศาเซลเซียส เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสจะเริ่มท�ำงานด้วยการเชื่อมต่อนิวคลีโอไทด์ทั้งสี่ชนิด
ตามเบสที่เป็นคู่สมกันตามล�ำดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอต้นแบบ การสร้างสายดีเอ็นเอเส้นใหม่จึงเกิดขึ้น ดังภาพ 3
ภาพ 3
ปฏิกิริยาพีซีอาร์ในแต่ละรอบ (แสดงเพียง 2 รอบ)
หลังจากเสร็จสิ้นสามขั้นตอน ถือเป็นหนึ่งรอบของปฏิกิริยา เพื่อให้ได้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการมากพอ จึงต้องมี
การท�ำซ�้ำในขั้นตอนที่หนึ่งถึงสามโดยอาศัยเครื่องพีซีอาร์ ซึ่งเปลี่ยนอุณหภูมิอัตโนมัติ ดังนั้นเครื่องเปลี่ยนอุณหภูมิอัตโนมัติ
จึงมีความจ�ำเป็นเพื่อให้เกิดความต่อเนื่องของปฏิกิริยา ด้วยเหตุนี้เองปฏิกิริยานี้จึงชื่อว่าปฏิกิริยาลูกโซ่
